Колиформные бактерии. Общие колиформные бактерии
Современная санитарная микробиология при индикации и идентификации санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов, при определении общей микробной обсемененности объектов окружающей среды стремится использовать все те методы, которые применяются в диагностических микробиологических лабораториях:
микроскопический – при индикации и прямом подсчете микроорганизмов в исследуемом объекте;
бактериологический – выделение микроорганизмов и их идентификация;
биологический – заражение чувствительных животных и ускоренные методы исследований (РИФ и др.).
Для получения разносторонней и полноценной санитарно-микробиологической характеристики объектов окружающей среды, как правило, используется комплекс тестов. К ним относится определение общей микробной обсемененности (общего микробного числа).
Общая микробная обсемененность объекта характеризуется количеством микроорганизмов в 1 мл воды, жидкости или в 1 г твердого вещества (продукта). Определение микробного числа является косвенным методом и позволяет судить о возможности загрязнения изучаемого объекта патогенными микроорганизмами.
Существует два метода определения микробной обсемененности:
Метод прямого подсчета под микроскопом;
Метод количественного посева различных разведений образцов и проб исследуемого объекта.
Первый метод – метод прямого подсчета микроорганизмов в исследуемом объекте проводится под микроскопом в счетных камерах Горяева или в камерах, специально сконструированных для подсчета бактерий. Предварительно пробу исследуемого объекта подвергают обработке, чтобы получить гомогенную взвесь. Для лучшего учета бактерий в исследуемую суспензию добавляют краситель.
Второй метод – метод количественного посева исследуемого материала на плотные питательные среды – применяется наиболее часто. Из приготовленных серийных десятикратных разведений исследуемой жидкости или суспензии по 1 мл переносят в стерильные чашки Петри (начиная с большего разведения, каждое разведение отдельной пипеткой) и заливают расплавленным и охлажденным до 45-50 0 С мясопептонным агаром.
Следует отметить, что оба метода определения общей микробной обсемененности, являются относительными и приблизительными. Для получения сравнимых результатов при определении общего микробного числа исследования проводятся по стандартным, конкретным для каждого случая методикам, регламентированным соответствующими ГОСТами.
Выявление в каждом конкретном случае порчи объекта окружающей среды ведется по схемам исследования, разработанным для каждой группы микроорганизмов.
Бактерии группы кишечных палочек (бгкп)
Впервые Escherihia coli (кишечную палочку) Т.Эшерих выделил в 1885 г из фекалий больного. Кишечная палочка является постоянным обитателем толстого отдела кишечника человека, млекопитающих, птиц и рыб. Среди бактерий E. сoli наряду с сапрофитными штаммами встречаются энтеропатогенные, способные вызвать желудочно-кишечные заболевания людей и животных.
Морфология. Это полиморфные палочки с закругленными концами длиной 1-3 мкм, грамотрицательные, не образующие спор, подвижные перитрихи (встречаются и неподвижные). Капсулу образуют лишь патогенные серовары (08, 09, 0101).
Культуральные свойства. Е. coli аэроб или факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 37-38 0 С, рН среды 7,0-7,4. Хорошо растет на обычных питательных средах – МПА, МПБ, средах Эндо и Левина. На МПА через 24 ч появляются сочные, круглые с ровными краями и гладкой поверхностью (s-форма) серо-белого цвета колонии. В МПБ образуют интенсивное помутнение среды и осадок на дне пробирки, легко разбивающийся при встряхивании.
Биохимические (ферментативные) свойства у бактерий E. сoli хорошо выражены, в отличие от других бактерий семейства Enterobacteriaciae они сбраживают лактозу до кислоты и газа, что используется для дифференциации и идентификации.
К бактериям группы кишечной палочки отнесены 3 рода бактерий: Escherihia, Citrobacter и Enterobacter. Два последних рода близки, в отличие от рода Escherihia они имеют ограниченное санитарное значение и не расцениваются как показатели свежего фекального загрязнения, так как их чаще обнаруживают в почве, на растениях.
Во всех ранее существовавших классификациях уделялось большое внимание способности кишечных палочек сбраживать лактозу, так как считалось, что средой обитания лактозоотрицательных палочек являются почва, вода, растения.
В связи с неодинаковым санитарно-показательным значением отдельных родов в настоящее время для дифференциации Escherihia coli фекального происхождения от других БГКП (Citrobacter и Enterobacter) предложен комплекс признаков обозначенных абревиатурой - ТИМАЦ.
Т – температурный тест (тест Эйкмана);
И – тест на индолообразование;
М – реакция с метиловым красным;
А - реакция на ацетиметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра);
Ц – цитратный тест.
Признаки, входящие в этот комплекс, определяют принадлежность БГКП к одному из трех родов: Escherihia, Citrobacter и Enterobacter.
Температурный тест. Для подтверждения фекального происхождения выделенных штаммов Escherihia coli, принимают ее способность сбраживать углеводы при температуре 43-44 0 С , превышающей температуру тела человека, т.е. температурный тест. Большинство бактерий родов Citrobacter и Enterobacter такой способностью не обладает.
Образование индола. Суть метода сводится к тому, что 98% выделенных штаммов Escherihia coli способны расщеплять аминокислоту триптофан, входящую в состав многих белков и пептонов питательной среды, с выделением ряда продуктов, в том числе и индола , окрашивающего питательную среду в красный цвет при взаимодействии с реактивами, содержащими параметиламидобензальдегид. Бактерии из родов Citrobacter и Enterobacter индол не образуют.
Реакция с метиловым красным (реакция Кларка). Эта реакция применяется для определения интенсивности кислотообразования при сбраживании глюкозы в питательной среде. В качестве индикатора используют метиловый красный, который изменяет окраску от светло-желтой до красной при рН 5,0 и ниже (при рН выше 5,0 среда остается светло-желтой). Считается, что типичные Escherihia coli сбраживают глюкозу до кислоты и газа более интенсивно, чем Enterobacter.
Образование ацетилметилкарбинола. С помощью этой реакции определяют способность микроорганизмов образовывать в среде с глюкозой ацетилметилкарбинол. Его образуют Enterobacter, а Escherihia coli и Citrobacter такой способностью не обладают.
Способность микроорганизмов образовывать в среде с глюкозой ацетилметилкарбинол определяют по следующей методике: к 5 мл культуры 4-5 суточного возраста, выращенной на пептонной воде с глюкозой или на среде Кларка, добавляют такой же объем 40%-ного раствора КОН. При наличии ацетилметилкарбинола среда окрашивается в розовый цвет.
Цитратный тест основан на способности некоторых микроорганизмов усваивать лимонную кислоту и ее соли в питательной среде.
Citrobacter и Enterobacter растут на цитратных средах и получили название цитратположительные бактерии, а Escherihia coli фекального происхождения не утилизируют цитрат и являются цитратотрицательными.
ГОСТом предусмотрено проведение цитратного теста при контроле молока и молочных продуктов на среде Козера.
Сбраживание лактозы. Во всех ранее существовавших классификациях уделялось большое внимание способности кишечной палочки сбраживать лактозу. Этот признак был дифференцирующим при определении санитарно-показательного значения изучаемых микроорганизмов. Считалось, что лактозоотрицательные варианты отличаются от лактозоположительных тем, что средой обитания их являются почва, вода, растения.
Однако в кишечнике человека и животных, а также во внешней среде можно обнаружить различные варианты кишечных палочек, которые имеют не типичные для рода Escherihia признаки. Это объясняется тем, что у кишечной палочки, под влиянием различных факторов внешней среды происходит изменение ряда биологических свойств: утрата способности сбраживать лактозу и ферментировать углеводы при 43 0 С и даже при 37 0 С.
Следовательно, этот признак нестабильный, поэтому в настоящее время при классификации или для подтверждения фекального происхождения выделенных штаммов кишечной палочки определяют способность не просто сбраживать лактозу, а способность сбраживать углеводы при температуре, превышающей температуру тела человека и животных, т.е. температурный тест.
В комплексе ТИМАЦ температурный и цитратный тесты являются основными, наиболее стабильными позволяющими дифференцировать БГКП фекального происхождения от бактерий группы кишечных палочек, обитающих во внешней среде.
Использование БГКП в качестве санитарно-показательных
микроорганизмов в пищевой санитарной микробиологии
БГКП считаются классическим индикатором фекального загрязнения объектов внешней среды. В зависимости от целей исследования учитывают всю группу кишечных палочек или отдельных ее представителей. БГКП с точки зрения их санитарно-гигиенического значения Г.П.Калина (1968) делит на 3 подгруппы.
К первой подгруппе можно отнести БГКП в широком смысле этого слова (грамотрицательные палочки, растущие на универсальных средах), сбраживающие глюкозу и лактозу или только глюкозу с образование К и Г (кислота и газ) при 37 0 С, которые не имеют собственно санитарного значения.
Во вторую группу входят бактерии, имеющие санитарно-показательное значение и указывающие на неопределенное по времени фекальное загрязнение, они обладают свойствами, характерными для первой подгруппы, но сбраживают глюкозу и лактозу или глюкозу при 43-45 0 С.
В третью подгруппу включают бактерии, являющиеся показателями свежего и несомненно фекального загрязнения (E. сoli). К ним относятся микроорганизмы, обладающие свойствами, характерными для бактерий второй подгруппы, но не растущие на среде Козера с цитратными солями и сбраживающие углеводы при 43-45 0 С.
В настоящее время многие исследователи считают, что при оценке качества воды и пищевых продуктов санитарно-показательное значение имеют представители любой из подгрупп кишечной палочки, способные размножаться при 43 0 С и сбраживать глюкозу с образованием газа.
Энтеропатогенные кишечные палочки
В своей естественной среде обитания – содержимом толстого кишечника – кишечная палочка является комменсалом и, несомненно, играет положительную роль.
В то же время в литературе многократно были описаны вспышки пищевых токсикоинфекций, вызванных энтеропатогенными кишечными палочками. Исследования антигенного строения кишечной палочки показали, что возбудителями кишечных заболеваний являются определенные серологические типы E. сoli:
У телят чаще выделяются серогруппы 08, 09, 015, 0101 и др;
У поросят – 08, 09, 0137, 0138 и др;
У человека 026, 055, 0111 и некоторые другие серогруппы, в основном обладающие соматическим О-антигеном. Эти типы относятся к энтеропатогенным.
Энтеропатогенные кишечные палочки вызывают заболевания: колибактериоз молодняка, мастит у коров, острые кишечные заболевания у детей. Энтеропатогенные типы кишечных палочек выделяются и от здоровых людей и животных. Имеются мнения, что основной причиной заболевания могут являться токсины, вырабатываемые кишечными палочками прижизненно и, следовательно, заболевания можно рассматривать скорее как интоксикацию, чем токсикоинфекцию.
Возможность возникновения заболевания у людей зависит от ряда факторов – дозы микроба, возраста заболевшего, состояния организма и др.
Обеззараживание условно годного мяса . Если есть дистрофические изменения в мышцах, то туши и внутренние органы подлежат утилизации. При отсутствии таких изменений, на утилизацию направляют только внутренние органы, а туши используют для приготовления продукции, в технологическом процессе которой предусматривается термическая обработка.
Бактерии группы кишечной палочки (БГКП - колиформные бактерии)
Выявление БГКП в пищевых продуктах свидетельствует об их фекальном загрязнении. БГКП могут попадать в продукты из воды, с оборудования, рук рабочего персонала и из других источников. БГКП подразделяют на две подгруппы:
- 1) общие колиформные бактерии, расщепляющие глюкозу, лактозу и маннит с образованием кислоты и газа при 37°С в течение 24 ч;
- 2) термотолерантные колиформные бактерии, расщепляющие глюкозу и лактозу с образованием кислоты и газа при 43-44,5°С.
В группу БГКП входят роды Escherichia , Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella , Serratia (табл. 12.2).
Род Escherichia. Типовым видом этого рода является Escherichia coli. Он играет важную роль в микробиоценозе кишечника человека и животных.
Е. coli - мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами размером (2-3) х (0,5-0,7) мкм. Не образуют спор, неподвижны. Есть варианты подвижные за счет перитрихиально расположенных жгутиков, капсул не имеют. Факультативные анаэробы. Получают энергию как в процессе дыхания, так и при брожении. При сбраживании углеводов Е. coli накапливают кислоты - молочную, уксусную, янтарную (положительная реакция с метиловым красным) и газы - С0 2 и Н 2 (бродильная проба). Эшерихии хорошо растут на простых питательных средах. Оптимальная температура роста составляет 37°С, оптимальное значение pH среды - 7,0-7,4.
Таблица 12.2
Признаки родов, относящихся к БГКП
|
Подвижность |
Сбраживание |
Образование |
Образование анетоина |
Расщепление цитратов |
Реакция с метиловым красным |
|
|
Escherichia |
||||||
|
Klebsiella |
||||||
|
Enterobacler |
||||||
|
Citrobacter |
||||||
|
Serratia |
Род Enterobacter. Представители рода обнаруживаются в пресной воде, почве, сточных водах, на растениях, овощах; их выделяют из кишечника человека и животных. Виды рода в последние годы выделяют при острых желудочно-кишечных заболеваниях, диспепсии, инфекциях желчных и мочевых путей, гнойных поражениях мозговых оболочек, сепсисе у людей и животных. Типовой вид - Е. cloacae.
Клетки Enterobacter - прямые палочки размером (2-3) х (0,5- 0,6) мкм, перитрихи, грамотрицательные, не образуют спор и капсул. Оптимальная температура роста 30-37°С. Биохимические признаки видов этого рода: образование ацетоина при сбраживании углеводов (положительная реакция Фогес-Проскауэра), расщепление цитрата натрия в среде Симмонса.
Род Citrobacter (citrus - (лимон) и bacter). Представители этого рода присутствуют в фекалиях человека и животных, почве, сточных водах, пищевых продуктах. При определенных условиях они могут вызывать заболевания, протекающие по типу гастроэнтеритов, диспепсий. При развитии гнойно-воспалительных процессов наиболее значимым является вид C.freundii, который является типовым видом данного рода. Клетки цитробактеров - прямые палочки размером (1-6) х (0,5-0,8) мкм, одиночные или в парах. Перитрихи. Спор и цист не образуют, капсул не образуют. С. freundii продуцирует сероводород. На кровяном агаре вокруг колоний образуются четкие зоны гемолиза.
Род Klebsiella назван в честь бактериолога Э. Клебса. Бактерии этого рода выделяют из воды, почвы, пищевых продуктов. Они присутствуют в биоценозах носоглотки, кишечника. Вызывают заболевание клебсиеллез у детей в возрасте до 1 года. Заболевание протекает в виде диареи, менингита, бронхопневмонии, гнойносептических воспалений. Представители рода: К. pneumonia ,
К. mobilis и сапрофитные виды: К. planticola, К. terrigena. Это прямые палочки размером (0,6-6,0) х (0,3-1,0) мкм, одиночные или в парах. Отличаются от других энтеробактерий характерными признаками: обладают классической полисахаридной капсулой и лишены жгутиков. Типовой вид - Klebsiella pneumonia.
Род Serratia. Название рода связано с именем итальянского физика Серафино Серрати. Они встречаются в почве, воде, на поверхности растений, а также в пищеварительном тракте человека, насекомых и грызунов в качестве комменсалов. У лиц с ослабленной иммунной системой серрации могут вызвать гнойные воспаления самой различной локализации. Типовой вид - Serratia marcescens. Serratia marcescens - это прямые мелкие палочки размером (0,5-0,8) х (0,9-2,0) мкм. Перитрихи при определенных условиях способны образовывать капсулу. Большинство колоний Serratia окрашены в различные оттенки красного цвета за счет образования пигмента продигиозина.
При характеристике БГКП учитываются следующие диффере- ницально-диагностические признаки:
- 1) инкубация посевов при едином температурном режиме - 37°С;
- 2) способность ферментировать лактозу - характер роста на среде Эндо (так называемый лактозный тест). Учитываются колонии темно-красные, с металлическим блеском или без него;
- 3) оксидазный тест: колонии на среде Эндо исследуются на наличие оксидазы. Для дальнейшей идентификации оставляют окси- дазоотрицательные колонии. Колонии с положительным окси- дазным тестом, относящиеся к грамотрицательным бактериям родов Pseudomonas, Aeromonas, Vibrio, не учитываются;
- 4) препараты из характерных колоний окрашивают по Граму - учитываются грамотрицательные палочки;
- 5) бродильная проба на среде Гисса с глюкозой для обнаружения способности бактерий ферментировать глюкозу с образованием кислоты и газа.
Помимо БГКП возбудителями кишечных заболеваний, вызванных употреблением контаминированных пищевых продуктов, могут быть также бактерии родов Morganella и Providencia из семейства Enteribacteriaceae.
До стерилизации. Воздух оценивают по содержанию золотистого стафилококка, попадающего в него из верхних дыхательных путей , ротовой полости . Его считают показателем капельного загрязнения воздуха . Другими микробами, отражающими санитарное неблагополучие того или иного объекта, являются дрожжевые и плесневые грибы , синегнойная палочка , сальмонеллы.
Общие и термотолерантные колиформные бактерии (в 3 пробах по 100 мл воды)
При определении качества воды необходимо вычислить количество присутствующих колиформных бактерий , чтобы определить, отвечает ли вода установленным стандартам. Для подсчета положительных колиформных анализов (предположительных, подтверждающих и фекальных) используется (Множество бродильных трубок. При подсчете применяют метод статистической обработки результатов анализов, проводимых с последовательным разбавлением пробы. Результаты исследований представляют в виде наиболее вероятного числа колиформных бактерий (НВЧ). Например, НВЧ 10 означает, что на 100 мл воды приходится 10 колиформных бактерий.
В большинстве случаев изучение восстановления количества бактерий проводили на общей и фекальной колиформных группах бактерий. При этом вопрос о том, насколько восстановление количества колиформных бактерий опасно для здоровья, остается открытым, так как различные виды бактерий имеют разные патогенные свойства , кроме того, ни общая, ни фекальная колиформные группы бактерий не являются единственными действующими в водяной среде болезнетворными микробиологическими факторами .
Целью этой работы было исследовать явление очевидного восстановления этих трех основных подгрупп колиформных бактерий в хлорированных сточных водах. Было проведено восстановления бактерий в хлорированных водах и их выживания в нехлорированных водах. В тех случаях, когда через большие промежутки времени после хлорирования уничтожение бактерий не отличается существенно от естественного, целесообразность хлорирования сомнительна, особенно если сточные воды не сразу используются человеком после их сбрасывания.
Приведенные данные показывают насколько статистически значителен рост содержания колиформных бактерий . Было обнаружено, что увеличивается содержание всех подгрупп бактерий максимальное содержание наблюдается на четвертый или пятый день (табл. 13.5).
| Рис. 12.3. Схема типовой установки для биологической очистки сточных вод и испытания, которые необходимо проводить для определения степени эффективности ее работы / - определение параметров расхода г - грубодисперсные примеси 3 - песколовка 4-первичный отстойник 5 - осадок из первичных отстойников 5 - уплотнитель 7 - иловая вода 8 уплотненный осадок 9 - вакуум-фильтр /О -фильтрат -кондиционирующие химические вещества т - кек 13 - биологическая очистка и отстаивание 14 - избыточный активный ил 5- хлорирование С - расход 55 - содержание взвешенных веществ У55 - потери при прокаливании взвешенных веществ - сухой остаток соИ1огтз - содержание фекальных колиформных бактерий |
Эффективность процесса дезинфекции определяется анализом на группу колиформных бактерий, являющихся индикаторами качества воды. Чувствительность бактерий к хлорированию хорошо известна, в то время как влияние хлорирования на простейшие и вирусы прослеживается не совсем четко. Личинки простейших и кишечные вирусы более устойчивы к действию хлора , чем колиформы и другие кишечные бактерии. Однако имеется очень мало данных, свидетельствующих о том, что существующая практика обработки воды несовершенна. Документально не были зафиксированы вспышки болезней, связанных с употреблением воды, содержащей вирусные или протозойные инфекции.
Почти во всех штатах теперь требуется проведение анализа обработанной воды на колиформные бактерии в этом случае число требуемых анализов зависит от численности обслуживаемого населения. Подсчет фекальных колиформ, хотя он обычно необязателен с точки зрения контролирующих органов, несложен и может дать дополнительную инь формацию относительно . Иногда применительно к конкретной установке специально устанавливают предельные значения некоторых показателей , таких, как концентрация остаточного хлора, мутность, содержание растворенных твердых частиц , нитратов, а также цветность. Концентрацию остаточного хлора в распределительной системе измеряют для того, чтобы определить, является ли достаточным хлорирование. Другие лабораторные анализы связаны с контролем химической обработки, выявлением и устранением некоторых проблем, возникающих в сооружениях распределительной системы, и с жалобами потребителей на качество воды . Химические реагенты должны отвечать требованиям соответствующих технических условий , и их следует подвергать традиционным анализам, причем при отклонении от технических условий на поставщика необходимо накладывать штраф. Например, известь обычно покупают с содержанием СаО 88-90%, квасцы-с 17%-ным содержанием AI2O3, а активный уголь - по спецификациям относительно содержания фенола. Если в контракте на поставку химических веществ предусмотрено наложение штрафов на поставщика на основании результатов лабораторных анализов, то это может оградить водоочистную установку от поступления в нее недоброкачественных материалов.
Восстановлевие содержания колиформных бактерий в хлорированных водах
Начальное
Организмы – индикаторы фекального загрязнения
Использование типичных кишечных организмов в качестве индикаторов фекального загрязнения (а не самих патогенных агентов) является общепризнанным принципом мониторинга и оценки микробиологической безопасности водоснабжения. В идеале обнаружение таких индикаторных бактерий должно означать возможное присутствие всех сопутствующих такому загрязнению патогенных агентов. Индикаторные микроорганизмы должны легко выделяться из воды, идентифицироваться и количественно определяться. При этом они должны дольше выживать и в водной среде, чем патогенные агенты, и должны быть более устойчивы к обеззараживающему действию хлора, чем патогенные. Практически какой-либо один организм не может отвечать всем этим критериям, хотя многие из них имеют место в случае колиформных организмов, особенно Е. соli – важного индикатора загрязнения воды фекалиями человека и животных. Другие организмы, удовлетворяющие некоторым из этих требований, хотя и не в такой степени, как колиформные организмы, также могут в некоторых случаях использоваться в качестве дополнительных показателей фекального загрязнения.
К колифрмным организмам, используемым в качестве индикаторов фекального загрязнения, относят общие колиформы, в т.ч. и Е. соli, фекальные стрептококки, сульфитредуцирующие спороносные клостридии, особенно, клостридия перфрингенс. Есть и другие анаэробные бактерии (к примеру, бифидобактерии), в больших количествах встречающиеся в фекалиях. При этом рутинные методы их обнаружения чересчур сложны и длительны. По этой причине специалисты в области водной бактериологии остановились на простых, доступных и достоверных методах количественного обнаружения индикаторных колиформных микроорганизмов, используя в работе титрационный метод (серийных разведений) или метод мембранных фильтров.
Колиформные организмы уже давно считаются удобными микробными индикаторами качества питьевой воды, главным образом потому, что легко поддаются обнаружению и количественному определению. Это грамотрицательные палочки, они обладают способностью ферментировать лактозу при 35-37 °С (общие колиформы) и при 44-44,5 °С (термотолерантные колиформы) до кислоты и газа, оксидазоотрицательные, не образуют спор и включают виды Е. соli, цитробактер, энтеробактер, клебсиеллу.
Общие колиформные бактерии согласно СанПиНу должны отсутствовать в 100 мл питьевой воды.
