Бактерии группы кишечных палочек. Бактерии колиформные в воде. Термотолерантные колиформные бактерии
1. Обзор литературных источников
.1 Систематика кишечной
палочки
Научная классификация
Домен: Бактерии
Тип: Протеобактерии
Класс: Гамма-протеобактерии
Порядок: Enterobacteriales
Семейство: Энтеробактерии
Род: Escherichia
Вид: Coli (Кишечная палочка)
Международное научное название
Escherichia coli (Migula 1895)
1.2 Строение и химический состав бактериальной клетки
Внутренняя организация бактериальной клетки сложна. Каждая систематическая группа микроорганизмов имеет свои специфические особенности строения.
Клетка бактерий одета плотной оболочкой. Этот поверхностный слой, расположенный снаружи от цитоплазматической мембраны, называют клеточной стенкой. Стенка выполняет защитную и опорную функции, а также придает клетке постоянную, характерную для нее форму (например, форму палочки или кокка) и представляет собой наружный скелет клетки. Эта плотная оболочка роднит бактерии с растительными клетками, что отличает их от животных клеток, имеющих мягкие оболочки. Внутри бактериальной клетки осмотическое давление в несколько раз, а иногда и в десятки раз выше, чем во внешней среде. Поэтому клетка быстро разорвалась бы, если бы она не была защищена такой плотной, жесткой структурой, как клеточная стенка.
Толщина клеточной стенки 0,01-0,04 мкм. Она составляет от 10 до 50% сухой массы бактерий. Количество материала, из которого построена клеточная стенка, изменяется в течение роста бактерий и обычно увеличивается с возрастом.
Основным структурным компонентом стенок, основой их жесткой структуры почти у всех исследованных до настоящего времени бактерий является муреин (гликопептид, мукопептид). Это органическое соединение сложного строения, в состав которого входят сахара, несущие азот, - аминосахара и 4-5 аминокислот. Причем аминокислоты клеточных стенок имеют необычную форму (D-стереоизомеры), которая в природе редко встречается.
С помощью способа окраски, впервые предложенного в 1884 г. Кристианом Грамом, бактерии могут быть разделены на двегруппы: грамположительныеиграмотрицательные.
Грамположительные организмы способны связывать некоторые анилиновые красители, такие, как кристаллический фиолетовый, и после обработки иодом, а затем спиртом (или ацетоном) сохранять комплекс иод-краситель. Те же бактерии, у которых под влиянием этилового спирта этот комплекс разрушается (клетки обесцвечиваются), относятся к грамотрицательным.
Химический состав клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий различен. У грамположительных бактерий в состав клеточных стенок входят, кроме мукопептидов, полисахариды (сложные, высокомолекулярные сахара), тейхоевые кислоты (сложные по составу и структуре соединения, состоящие из сахаров, спиртов, аминокислот и фосфорной кислоты). Полисахариды и тейхоевые кислоты связаны с каркасом стенок - муреином. Какую структуру образуют эти составные части клеточной стенки грамположительных бактерий, мы пока еще не знаем. С помощью электронных фотографий тонких срезов (слоистости) в стенках грамположительных бактерий не обнаружено. Вероятно, все эти вещества очень плотно связаны между собой.
В стенках грамотрицательных содержится значительное количество липидов (жиров), связанных с белками и сахарами в сложные комплексы - липопротеиды и липополисахариды. Муреина в клеточных стенках грамотрицательных бактерий в целом меньше, чем у грамположительных бактерий. Структура стенки грамотрицательных бактерий также более сложная. С помощью электронного микроскопа было установлено, что стенки этих бактерий многослойные.
Внутренний слой состоит из муреина. Над ним находится более широкий слой из не плотно упакованных молекул белка. Этот слой в свою очередь покрыт слоем липополисахарида. Самый верхний слой состоит из липопротеидов.
Клеточная стенка проницаема: через нее питательные вещества свободно проходят в клетку, а продукты обмена выходят в окружающую среду. Крупные молекулы с большим молекулярным весом не проходят через оболочку.
Клеточная стенка многих бактерий сверху окружена слоем слизистого материала - капсулой. Толщина капсулы может во много раз превосходить диаметр самой клетки, а иногда она настолько тонкая, что ее можно увидеть лишь через электронный микроскоп, - микрокапсула.
Капсула не является обязательной частью клетки, она образуется в зависимости от условий, в которые попадают бактерии. Она служит защитным покровом клетки и участвует в водном обмене, предохраняя клетку от высыхания.
По химическому составу капсулы чаще всего представляют собой полисахариды. Иногда они состоят изгликопротеидов (сложные комплексы сахаров и белков) и полипептидов (род Bacillus), в редких случаях - из клетчатки (род Acetobacter).
Слизистые вещества, выделяемые в субстрат некоторыми бактериями, обусловливают, например, слизисто-тягучую консистенцию испорченного молока и пива.
Все содержимое клетки, за исключением ядра и клеточной стенки, называется цитоплазмой. В жидкой, бесструктурной фазе цитоплазмы (матриксе) находятся рибосомы, мембранные системы, митохондрии, пластиды и другие структуры, а также запасные питательные вещества. Цитоплазма обладает чрезвычайно сложной, тонкой структурой (слоистая, гранулярная). С помощью электронного микроскопа раскрыты многие интересные детали строения клетки.
Внешний липопротвидный слой протопласта бактерий, обладающий особыми физическими и химическими свойствами, называется цитоплазматической мембраной.
Внутри цитоплазмы находятся все жизненно важные структуры и органеллы.
Цитоплазматическая мембрана выполняет очень важную роль - регулирует поступление веществ в клетку и выделение наружу продуктов обмена.
Через мембрану питательные вещества могут поступать в клетку в результате активного биохимического процесса с участием ферментов. Кроме того, в мембране происходит синтез некоторых составных частей клетки, в основном компонентов клеточной стенки и капсулы. Наконец, в цитоплазматической мембране находятся важнейшие ферменты (биологические катализаторы). Упорядоченное расположение ферментов на мембранах позволяет регулировать их активность и предотвращать разрушение одних ферментов другими. С мембраной связаны рибосомы - структурные частицы, на которых синтезируется белок. Мембрана состоит из липопротеидов. Она достаточно прочна и может обеспечить временное существование клетки без оболочки. Цитоплазматическая мембрана составляет до 20% сухой массы клетки.
На электронных фотографиях тонких срезов бактерий цитоплазматическая мембрана представляется в виде непрерывного тяжа толщиной около 75A, состоящего из светлого слоя (липиды), заключенного между двумя более темными (белки). Каждый слой имеет ширину 20-30А. Такая мембрана называется элементарной.
Между плазматической мембраной и клеточной стенкой имеется связь в виде десмозов - мостиков. Цитоплазматическая мембрана часто дает инвагинации - впячивания внутрь клетки. Эти впячивания образуют в цитоплазме особые мембранные структуры, названные мезосомами.Некоторые виды мезосом представляют собой тельца, отделенные от цитоплазмы собственной мембраной. Внутри таких мембранных мешочков упакованы многочисленные пузырьки и канальцы. Эти структуры выполняют у бактерий самые различные функции. Одни из этих структур - аналоги митохондрий. Другие выполняют функции зндоплазматической сети или аппарата Гольджи. Путем инвагинации цитоплазматической мембраны образуется также фотосинтезирующий аппарат бактерий. После впячивания цитоплазмы мембрана продолжает расти и образует стопки, которые по аналогии с гранулами хлоропластов растений называют стопками тилакоидов. В этих мембранах, часто заполняющих собой большую часть цитоплазмы бактериальной клетки, локализуются пигменты (бактериохлорофилл, каротиноиды) и ферменты (цитохромы), осуществляющие процесс фотосинтеза.
В цитоплазме бактерий содержатся рибосомы - белок-синтезирующие частицы диаметром 200А. В клетке их насчитывается больше тысячи. Состоят рибосомы из РНК и белка. У бактерий многие рибосомы расположены в цитоплазме свободно, некоторые из них могут быть связаны с мембранами.
В цитоплазме клеток бактерий часто содержатся гранулы различной формы и размеров. Однако их присутствие нельзя рассматривать как какой-то постоянный признак микроорганизма, обычно оно в значительной степени связано с физическими и химическими условиями среды. Многие цитоплазматические включения состоят из соединений, которые служат источником энергии и углерода. Эти запасные вещества образуются, когда организм снабжается достаточным количеством питательных веществ, и, наоборот, используются, когда организм попадает в условия, менее благоприятные в отношении питания.
У многих бактерий гранулы состоят из крахмала или других полисахаридов - гликогена и гранулезы. У некоторых бактерий при выращивании на богатой сахарами среде внутри клетки встречаются капельки жира. Другим широко распространенным типом гранулярных включений является волютин (метахроматиновые гранулы). Эти гранулы состоят из полиметафосфата (запасное вещество, включающее остатки фосфорной кислоты). Полиметафосфат служит источником фосфатных групп и энергии для организма. Бактерии чаще накапливают волютин в необычных условиях питания, например на среде, не содержащей серы. В цитоплазме некоторых серных бактерий находятся капельки серы.
Помимо различных структурных компонентов, цитоплазма состоит из жидкой части - растворимой фракции. В ней содержатся белки, различные ферменты, т-РНК, некоторые пигменты и низкомолекулярные соединения - сахара, аминокислоты.
В результате наличия в цитоплазме низкомолекулярных соединений возникает разность в осмотическом давлении клеточного содержимого и наружной среды, причем у разных микроорганизмов это давление может быть различным. Наибольшее осмотическое давление отмечено у грамположительных бактерий - 30 атм, у грамотрицательных бактерий оно гораздо ниже 4-8 атм.
В центральной части клетки локализовано ядерное вещество - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК).
У бактерий нет такого ядра, как у высших организмов (эукариотов), а есть его аналог - «ядерный эквивалент» - нуклеоид, который является эволюционно более примитивной формой организации ядерного вещества. Микроорганизмы, не имеющие настоящего ядра, а обладающие его аналогом, относятся к прокариотам. Все бактерии - прокариоты. В клетках большинства бактерий основное количество ДНК сконцентрировано в одном или нескольких местах. У бактерий ДНК упакована менее плотно, в отличие от истинных ядер; нуклеоид не обладает мембраной, ядрышком и набором хромосом. Бактериальная ДНК не связана с основными белками - гистонами - и в нуклеоиде расположена в виде пучка фибрилл.
На поверхности некоторых бактерий имеются придаточные структуры; наиболее широко распространенными из них являются жгутики - органы движения бактерий.
Жгутик закрепляется
под цитоплазматической мембраной с помощью двух пар дисков. У бактерий может
быть один, два или много жгутиков. Расположение их различно: на одном конце
клетки, на двух, по всей поверхности. Жгутики бактерий имеют диаметр 0,01-0,03
мкм, длина их может во много раз превосходить длину клетки. Бактериальные жгутики
состоят из белка - флагеллина - и представляют собой скрученные винтообразные
нити.
1.3 Морфология кишечной палочки и ее представителей
кишечный палочка микрофлора
Кишечная палочка - это полиморфная факультативная анаэробная короткая (длина 1-3 мкм, ширина 0,5-0,8 мкм) грамотрицательная палочка с закругленным концом. Штаммы в мазках располагаются беспорядочно, не образуя спор и перитрих. Некоторые штаммы имеют микрокапсулу и пили, широко встречается в нижней части кишечника теплокровных организмов. Большинство штаммов E. coli являются безвредными, однако серотип O157:H7 может вызывать тяжёлые пищевые отравления у людей.
Бактерии группы кишечных палочек хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонном агаре (МПА). На среде Эндо образуют плоские красные колонии средней величины. Красные колонии могут быть с темным металлическим блеском (Е. coli) или без блеска (E.aerogenes).
Обладают высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других сахаров, а также спиртов. Не обладают оксидазной активностью. По способности расщеплять лактозу при температуре 37°С бактерии делят на лактозоотрицателъные и лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП), или колиформные, которые формируются по международным стандартам. Из группы ЛКП выделяются фекальные кишечные палочки (ФКП), способные ферментировать лактозу при температуре 44,5°С..coli не всегда обитают только в желудочно-кишечном тракте, способность некоторое время выживать в окружающей среде делает их важным индикатором для исследования образцов на наличие фекальных загрязнений.
Общие колиформные бактерии (ОКБ) - грамотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37 +/- 1°C в течение 24 - 48 ч.
Колиформные бактерии (колиформы) - группа грамотрицательных палочек, в основном живущих и размножающихся в нижнем отделе пищеварительного тракта человека и большинства теплокровных животных (например, домашнего скота и водоплавающих птиц). Вводу попадают, как правило, с фекальными стоками и способны выживать в ней в течение нескольких недель, хотя при этом (в подавляющем большинстве) не размножаются.
Термотолерантные колиформные бактерии играют важную роль при оценке эффективности очистки воды от фекальных бактерий. Более точным индикатором служит именно E. coli (кишечная палочка), так как источником некоторых других термотолерантных колиформ могут служить не только фекальные воды. В тоже время общая концентрация термотолерантных колиформ в большинстве случаев прямо пропорциональна концентрации E. coli, а их вторичный рост в распределительной сети маловероятен (за исключением случаев наличия в воде достаточного количества питательных веществ, при температуре выше 13 °C.
Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) - входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44 +/ - 0,5 °C в течение 24 ч.
Включают род эшерихия и в меньшей степени отдельные штаммы цитробактер, энтеробактер и клебсиеллу. Из этих организмов только Е. соli специфично фекального происхождения, причем она всегда присутствует в больших количествах в экскрементах человека и животных и редко обнаруживается в воде и почве, не подвергшихся фекальному загрязнению. Считается, что обнаружение и идентификация Е. соli дает достаточную информацию для установления фекальной природы загрязнения.
Колиформы в большом количестве содержатся в бытовых сточных водах, а также в поверхностном стоке с территорий скотоводческих ферм. В водоисточниках, используемых для централизованного питьевого и хозяйственно-бытового водоснабжения, допускается численность общих колиформ не более 1000 единиц (КОЕ/100 мл, КОЕ - колониеобразующие единицы), а термотолерантных колиформ - не более 100 единиц. В питьевой воде колиформыне должны обнаруживаться в пробе объемом 100 мл. Допускается случайное попадание колиформных организмов в распределительную систему, но не более чем в 5% проб, отобранных в течение любого 12-месячного периода при условии отсутствия E. coli.
Присутствие колиформных организмов в
воде свидетельствует о ее недостаточной очистке, вторичном загрязнении или о
наличии в воде избыточного количества питательных веществ.
2. Материалы и методы
исследования
При исследовании относительно чистой в микробном отношении воды на наличие патогенных микроорганизмов необходимо концентрировать искомую микрофлору, содержащуюся в ничтожно малом количестве в воде. Обнаружение возбудителей кишечных инфекций в воде открытых водоемов и сточных водах на фоне преобладающей массы сапрофитной микрофлоры наиболее эффективно при концентрировании искомых бактерий в средах накопления, которые угнетают рост сопутствующей микрофлоры. Следовательно, при проведении анализа воды, имеющей различную степень общего микробного загрязнения, используют определенные методы выделения патогенной микрофлоры.
Открытые ведаемы обычно характеризуется значительным содержанием взвешенных веществ, т.е. мутностью, часто цветностью, малым содержанием солей, относительно малой жесткостью, наличием большого количества органических веществ, относительно высокой окисляемостью и значительным содержанием бактерий. Сезонные колебания качества речной воды нередко бывают весьма резкими. В период паводков сильно возрастает мутность и бактериальная загрязненность воды, но обычно снижается ее жесткость (щелочность и солесодержание). Сезонные изменения качества воды в значительной степени влияют на характер работы очистных сооружений водопровода в отдельные периоды года.
Количество микробов в 1 мл воды зависит от наличия в ней питательных веществ. Чем вода загрязненнее органическими остатками, тем больше в ней микробов.Особенно богаты микробами открытые водоемы и реки. Наибольшее количество микробов в них находится в поверхностных слоях (в слое 10 см от поверхности воды) прибрежных зон. С удалением от берега и увеличением глубины количество микробов уменьшается.
Речной ил богаче микробами, чем речная вода. В самом поверхностном слое ила бактерий так много, что образуется из них как бы пленка. В этой пленке содержится много нитчатых серобактерий, железобактерий, они окисляют сероводород до серной кислоты и этим препятствуют угнетающему действию сероводорода (предотвращается замор рыб).
Реки в районах городов часто являются естественными приемниками стоков хозяйственных и фекальных нечистот, поэтому в черте населенных пунктов резко увеличивается количество микробов. Но по мере удаления реки от города число микробов постепенно уменьшается, и через 3-4 десятка километров снова приближается к исходной величине. Это самоочищение воды зависит от ряда факторов: механическое осаждение микробных тел; уменьшение в воде питательных веществ, усвояемых микробами; действие прямых лучей солнца; пожирание бактерий простейшими и др.
Патогенны могут
попадать в реки и водоемы со сточными водами. Бруцеллезная палочка, палочка
туляремии, вирус полиомиелита, вирус ящура, а также возбудители кишечных
инфекций - палочка брюшного тифа, палочка паратифа, дизентерийная палочка,
холерный вибрион - могут сохраняться в воде длительное время, и вода может
стать источником инфекционных заболеваний. Особенно опасно попадание
болезнетворных микробов в водопроводную сеть, что случается при ее
неисправности. Поэтому за состоянием водоемов и подаваемой из них водопроводной
воды установлен санитарный биологический контроль.
2.1 Гидрометрический поплавковый метод измерения и определения скорости течения воды
Для измерения и определения скорости
течения воды существует - поплавковый метод, который основан на отслеживании
движения предмета, опущенного в поток (поплавка) с помощью приборов или
невооруженным глазом. Поплавки сбрасываются в воду на малых реках с берега или
с лодки. По секундомеру определяется время и прохождение поплавка между двумя
соседними створами, расстояние между которыми известно. Поверхностная скорость
течения приравнивается скорости движения поплавка. Поделив пройденное поплавком
расстояние на время наблюдения, получают скорость потока.
2.2 Отбор воды, хранение
и транспортировка проб
Пробы воды для бактериологического анализа отбирают с соблюдением правил стерильности: в стерильные бутылки или стерильными приборами - батометрами в количестве 1 л.
Для отбора воды из открытых водоемов, сточных вод, воды из бассейнов, колодцев удобен так называемый бутылочный батометр.
Методические указания по обнаружению возбудителей кишечных инфекций бактериальной природы в воде.
При отборе проб воды из открытых водоемов следует предусмотреть следующие точки: в месте застоя и в месте наиболее быстрого течения (с поверхности и на глубине 50 - 100 см).
Бутылочный батометр. Батометры -
приборы различной конструкции для взятия проб воды с разных глубин. В
классическом виде это цилиндры, которые можно опустить на определенную глубину,
там закрыть и извлечь. Самостоятельно изготовить классический батометр
непросто. Но вместо него можно использовать простую стеклянную или пластиковую
бутылку с узким горлышком, утяжеленную каким-либо грузом и заткнутую пробкой,
идеально - корковой. К горлышку бутылки и к пробке привязываются веревки.
Опустив бутылку на нужную глубину (главное, чтобы она тонула, для этого и нужен
груз), необходимо выдернуть пробку - поэтому затыкать ее туго не следует. Дав
бутылке время наполниться на нужной глубине (1-2 мин), ее вытаскивают на
поверхность. Делать это следует как можно более энергично - при большой
скорости подъема и узком горлышке вода из вышележащих слоев практически не
попадет внутрь.
Пробы, поднятые на поверхность с помощью батометра, также следует «сгущать»,
используя планктонную сеть, а затем рассчитывать объем процеженной воды.
Поскольку этот объем должен быть, по возможности, большим, батометр следует
делать как можно большего размера, например использовать 2-литровую стеклянную
или пластиковую бутылку или какой-либо еще сосуд большого размера с узким
горлом. На веревке, к которой привязана бутылка, также следует сделать отметки
через каждый метр - для определения глубины отбора проб.
Первая контрольная точка у дамбы (начало пляжа) - точка забора (ТЗ1).
Вторая контрольная точка у лодочной
станции (конец пляжа) - точка забора (ТЗ2).
Т31-первая контрольная точка у дамбы
(начало пляжа) Т32-вторая контрольная точка у лодочной станции (конец пляжа)
2.3 Хранение и
транспортирование проб
К исследованию проб в лаборатории необходимо приступить как можно быстрее с момента отбора.
Анализ следует провести в течение 2-х часов после забора.
Если не может быть
соблюдено время доставки пробы и температура хранения, анализ пробы проводить
не следует.
2.4 Подготовка посуды к анализу
Лабораторная посуда должна быть тщательно вымыта, ополоснута дистиллированной водой до полного удаления моющих средств и других посторонних примесей и высушена.
Пробирки, колбы, бутылки, флаконы должны быть заткнуты силиконовыми или ватно-марлевыми пробками и упакованы так, чтобы исключить загрязнение после стерилизации в процессе работы и хранения. Колпачки могут быть металлические, силиконовые, из фольги или плотной бумаги.
Новые резиновые пробки кипятят в 2%-м растворе натрия двууглекислого 30 минут и 5 раз промывают водопроводной водой (кипячение и промывание повторяют дважды). Затем пробки 30 минут кипятят в дистиллированной воде, высушивают, заворачивают в бумагу или фольгу и стерилизуют в паровом стерилизаторе. Резиновые пробки, использованные ранее, обеззараживают, кипятят 30 минут в водопроводной воде с нейтральным моющим средством, промывают в водопроводной воде, высушивают, монтируют и стерилизуют.
Пипетки со вставленными тампонами из ваты должны быть уложены в металлические пеналы или завернуты в бумагу.
Чашки Петри в закрытом состоянии должны быть уложены в металлические пеналы или завернуты в бумагу.
Подготовленную посуду стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160-170°С 1 час, считая с момента достижения указанной температуры. Простерилизованную посуду можно вынимать из сушильного шкафа только после его охлаждения ниже 60 °С.
После выполнения анализа все использованные чашки и пробирки обеззараживают в автоклаве при (126±2)°С 60 минут. Пипетки обеззараживают кипячением в 2%-м растворе NaHC03.
После охлаждения удаляют остатки сред, затем чашки и пробирки замачивают, кипятят в водопроводной воде и моют с последующим ополаскиванием дистиллированной водой.
В чашки Петри заливают заранее
приготовленный питательный агар ЭНДО и ставят для застывания.
2.5 Метод мембранных фильтров
Mетод определения количества клеток E.coli в единице объема жидкости (коли-индекс); суть метода заключается в фильтровании анализируемой жидкости через мембранные фильтры, задерживающие бактерии, после чего эти фильтры помещают на твердую питательную среду и подсчитывают выросшие на ней колонии бактерий.
Подготовка мембранных фильтров
Мембранные фильтры должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями завода - изготовителя.
Подготовка фильтровального аппарата
Фильтровальный аппарат обтирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и фламбируют. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.
При методе мембранных фильтров определенное количество воды пропускается через специальную мембрану с размером пор порядка 0.45 мкм.
В результате, на поверхности мембраны остаются все находящиеся в воде бактерии. После чего мембрану с бактериями помещают на специальную питательную среду (ЭНДО). После чего чашки Петри переворачивали и помещали в термостат на определенное время и температуру. Общие колиформные бактерии (ОКБ) - инкубировали при температуре 37 +/- 1°C в течение 24-48 ч. Для определения термотолерантных бактерий посев производят в среду, предварительно прогретую до температуры 44°С, и инкубируют при этой же температуре в течение 24 часов.
Среда светочувствительна. Поэтому все засеянные чашки предохраняют от света.
Во время этого периода, называемого инкубационным, бактерии получают возможность размножиться и образовать хорошо различимые колонии, которые уже легко поддаются подсчету.
По окончании сроков инкубации производят просмотр посевов:
а) отсутствие микробного роста на фильтрах или обнаружение на них колоний, не характерных для бактерий кишечной группы (губчатые, пленчатые с неровной поверхностью и краем), позволяет на этом этапе анализа закончить исследования (18-24 ч) с выдачей отрицательного результата на присутствие кишечных палочек в анализируемом объеме воды;
б) при обнаружении на фильтре колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых и прозрачных), исследование продолжают и микроскопируют.
Если рост круглых колоний малинового цвета с металлическим блеском диаметром 2,0-3,0 мм - Escherichia coli 3912/41 (055:K59);
Если рост круглых колоний малинового
цвета диаметром 1,5-2,5 мм с нечетким металлическим блеском - Escherichia coli
168/59 (O111:K58)
2.6 Учет результатов
После инкубационного периода 48 часов для общих колиформных бактерий и 24 часа для термоталерантных бактерий производят подсчет выросших на чашках колоний.
Колонии, выросшие на поверхности, а также в глубине агара, подсчитывали с помощью лупы с пятикратным увеличением или специальным прибором с лупой. Для этого чашку кладут вверх дном на черный фон и каждую колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.
Для подтверждения наличия ОКБ исследуют:
все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;
не менее 3 - 4 колоний каждого типа.
Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но не более 10.
Подсчитывают число колоний каждого типа.
Вычисление и представление результатов.
Результат анализа выражают числом колоний образующих единиц (КОЕ) общих колиформных бактерий в 100 мл воды. Для подсчета результата суммируют число колоний, подтвержденных как общие колиформные бактерии, выросших на всех фильтрах, и делят на 3.
Так как такой метод анализа воды предполагает только определение общего числа колонии - образующих бактерий разных типов, то по его результатам нельзя однозначно судить о присутствии в воде патогенных микробов. Однако, высокое микробное число свидетельствует об общей бактериологической загрязненности воды и о высокой вероятности наличия патогенных организмов.
Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на принадлежность к Граму.
Окраска по Граму
Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Особенностью окраски по Граму является неодинаковое отношение различных микроорганизмов к красителям трифенилметановой группы: генциановому, метиловому или кристаллическому фиолетовому. Микроорганизмы, входящие в группу грамположительных Грам (+), например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы (бактероиды, фузобактерии и др.) образуют с генциановым кристаллическим или метиленовым фиолетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Реактивы: карболовый раствор генцианвиолета или кристалвиолета, водный раствор Люголя, 96% этиловый спирт, водно-спиртовой раствор фуксина.
Методика окраски. На фиксированный
мазок накладывают кусочек фильтровальной бумаги и на нее наливают карболовый
раствор генцианвиолета от 1/2 до 1 минуты. Сливают краситель и, не смывая,
наливают раствор Люголя на 1 минуту. Сливают раствор Люголя и прополаскивают
препарат в 96% спирте в течение от 1/2 до 1 минуты, пока не перестанет отходить
краситель. Промывают водой. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином от
1/2 до 1 минуты. Сливают краситель, промывают и высушивают препарат.
3. Результаты исследования
.1 Микробиологический анализ воды Печерского озера (на примере E . coli ) в весенний период (май) исследования 2009-2013 гг.
В результате
трехкратного забора воды в двух точках отбора проб (ТЗ1 - в начале пляжа, у
дамбы, ТЗ2 - конец пляжа, лодочная станция) нами были высчитаны средние
показатели ОКБ и ТКБ, результаты которых представлены в таблице 3.1.
Таблица 3.1.
Средние показатели ОКБ и ТКБ в воде Печерского озера за май 2013 г.
Показатель содержания бактерий E.coli по ОКБ в начале и в
конце мая в ТЗ1 (у дамбы) не различаются, составив 195 КОЕ/см 3 , что
в 3,3 раза меньше по сравнению с пробой воды, отобранной в ТЗ2 (у лодочной
станции) в начале мая и в 4,3 раза больше в конце мая. Изучение динамики содержания
кишечной палочки в воде Печерского озера за май 2013 года по данным СЭС
подтвердил правильность проведения собственных исследований и показала, что
показатель ОКБ в ТЗ2 в 3,4 раза выше чем в ТЗ1 (по собственным результатам в
3,3 раза больше). Изучение изменения показателей ОКБ и
ТКБ за месяц май с 2009 по 2013 гг. показало широкое варьирование показателей,
что наглядно представлено на рисунках 3.1 - 3.2 Анализ данных учреждения
здравоохранения «Могилевского зонального центра гигиены и эпидемиологии» за
начало мая 2008-2013 гг.
По окончанию анализа данных за
начало мая 2008-2013 гг., мы установили что в 2008,2012 годах в ТЗ1 ОКБ
оказалось больше чем в ТЗ2. Анализ данных учреждения
здравоохранения «Могилевского зонального центра гигиены и эпидемиологии» за
конец мая 2008-2013 гг. Общие колиформные бактерии согласно
СанПиНу должны отсутствовать в 100 мл питьевой воды Термотолерантные фекальные колиформы
согласно СанПиНу должны отсутствовать в 100 мл исследуемой питьевой воды. Для открытых водоемов по ОКБ не
более 500 КОЕ на 100 мл воды, по ТКБ не более 100 КОЕ на 100 мл воды. Наличие в воде кишечных палочек
подтверждает фекальную природу загрязнения.
По результатам измерений
в летнюю межень колиформные бактерии присутствуют в небольших количествах, обычно
от ста до нескольких сот единиц, и лишь в периоды паводков кратковременно
повышаются до 1000 и более единиц. Низкие значения летом
могут быть связаны с несколькими факторами: ) интенсивной солнечной
радиацией, которая губительна для бактерий; ) повышенными значениями
рН в летний период (летом обычно рН > 8, зимой < 8) за счет развития
фитопланктона; ) выделением в воду
метаболитов фитопланктона, ингибирующих бактериальную флору. С началом осенне-зимнего
сезона перечисленные факторы существенно ослабляются, и численность бактерий
повышается до уровня нескольких тысяч единиц. Наибольшие экстремумы попадают на
периоды таяния снега, особенно в половодье, когда талые воды смывают бактерии с
поверхности водосбора. Общее число колонии
образующих бактерий в середине лета как привело ниже, чем в весенне-осенний
период, что связано с интенсивной солнечной радиацией, которая губительна для
бактерий. Реки в районах городов
часто являются естественными приемниками стоков хозяйственных и фекальных
нечистот, поэтому в черте населенных пунктов резко увеличивается количество
микробов. Но по мере удаления реки от города число микробов постепенно
уменьшается, и через 3-4 десятка километров снова приближается к исходной
величине. Наибольшее
количество микробов в открытых водоемах находится в поверхностных слоях (в слое
10 см от поверхности воды) прибрежных зон. С удалением от берега и увеличением
глубины количество микробов уменьшается. Речной ил богаче
микробами, чем речная вода. В самом поверхностном слое ила бактерий так много,
что образуется из них как бы пленка. В этой пленке содержится много нитчатых
серобактерий, железобактерий, они окисляют сероводород до серной кислоты и этим
препятствуют угнетающему действию сероводорода (предотвращается замор рыб).
Заключение
кишечный палочка возбудитель
бактерия Для нахождения и идентификации
кишечной палочки был произведен микробиологический анализ проб за начало мая
2013 г. Также осуществлен статистический анализ данных учреждения
здравоохранения «Могилевского зонального центра гигиены и эпидемиологии» за
начало мая 2008-2012 гг. По окончанию анализа было
установлено, что рассчитанное нами число бактерий группы кишечных палочек не
превышает допустимой нормы. По окончанию статистического анализа
данных учреждения здравоохранения «Могилевского зонального центра гигиены и
эпидемиологии» за 2008-2012 гг., было установлено, что в летнюю межень
колиформные бактерии присутствуют в небольших количествах. Общее число колонии
образующих бактерий в середине лета как привело ниже, чем в весенне-осенний
период, так как интенсивной солнечной радиацией, которая губительна для
бактерий, а с началом осенне-зимнего сезона численность бактерий повышается до
уровня нескольких тысяч единиц. Наибольшие экстремумы попадают на периоды
таяния снега, особенно в половодье, когда талые воды смывают бактерии с
поверхности водосбора.
Список литературы
1. Фомин Г.С. Вода.
Контроль химической, бактериальной и радиационной безопасности по международным
стандартам. Энциклопедический справочник. М.: Изд-во «Протектор», 1995. Долгоносов Б.М.,
Дятлов Д.В., Сураева Н.О., Богданович О.В., Громов Д.В., Корчагин К.А.
Информационно-моделирующая система Aqua CAD - инструмент по управлению
технологическими режимами на водопроводной станции // Водоснабжение и
санитарная техника. 2003. №6. С. 26-31. Долгоносов Б.М.,
Храменков С.В., Власов Д.Ю., Дятлов Д.В., Сураева Н.О., Григорьева С.В.,
Корчагин К.А. Прогноз показателей качества воды на входе водопроводной станции
// Водоснабжение и санитарная техника 2004. №11. С. 15-20. Кочемасова З.Н.,
Ефремова С.А., Рыбакова А.М. Санитарная микробиология и вирусология. М.:
Медицина, 1987. СанПиН 2.1.5.980-00.
Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов. Гигиенические
требования к охране поверхностных вод. СанПиН 2.1.4.1074-01.
Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем
питьевого водоснабжения. Контроль качества. МУК 4.2.1018-01.
Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы.
Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды.
Cтраница 1
Присутствие колиформных бактерий также определяют в воде всех видов. Термотолерантные колиформные бактерии быстро отмирают во внешней среде, поэтому их обнаружение свидетельствует о свежем фекальном загрязнении воды.
Для определения колиформных бактерий в питьевой воде и воде очищенной используют метод мембранных фильтров. Подсчитывают количество выросших на фильтрах лактозоположительных колоний, идентифицированных как колиформные бактерии.
При отсутствии общих колиформных бактерий проводится определение глюко-зоположительных колиморфных бактерий (БГКП) с постановкой оксидазного теста.
Например, основной показатель фекального загрязнения - колиформные бактерии, их определение проводят в смывах с рук, спецодежды персонала, лабораторной посуды, в нестерильных лекарственных формах, инъекционных растворах и глазных каплях до стерилизации. Воздух оценивают по содержанию золотистого стафилококка, попадающего в него из верхних дыхательных путей, ротовой полости. Его считают показателем капельного загрязнения воздуха. Другими микробами, отражающими санитарное неблагополучие того или иного объекта, являются дрожжевые и плесневые грибы, синегнойная палочка, сальмонеллы.
Эффективность процесса дезинфекции определяется анализом на группу колиформных бактерий, являющихся индикаторами качества воды. Чувствительность бактерий к хлорированию хорошо известна, в то время как влияние хлорирования на простейшие и вирусы прослеживается не совсем четко. Личинки простейших и кишечные вирусы более устойчивы к действию хлора, чем колиформы и другие кишечные бактерии. Однако имеется очень мало данных, свидетельствующих о том, что существующая практика обработки воды несовершенна. Документально не были зафиксированы вспышки болезней, связанных с употреблением воды, содержащей вирусные или протозойные инфекции.
Приведенные данные показывают насколько статистически значителен рост содержания колиформных бактерий.
При определении качества воды необходимо вычислить количество присутствующих колиформных бактерий, чтобы определить, отвечает ли вода установленным стандартам. Для подсчета положительных колиформных анализов (предположительных, подтверждающих и фекальных) используется множество бродильных трубок. При подсчете применяют метод статистической обработки результатов анализов, проводимых с последовательным разбавлением пробы. Например, НВЧ 10 означает, что на 100 мл воды приходится 10 колиформных бактерий.
Естественное очищение приводит к уменьшению мутности, цветности и содержания колиформных бактерий, а также к устранению суточных колебаний в качественных показателях. С другой стороны, рост водорослей может привести увеличению мутности и к образованию летом и осенью трудноудалимых привкусов и запахов. Хлорирование может быть как предварительной, так и последней (вторичной) стадией обработки воды, обеспечивая дезинфекцию сырой воды и установление должной концентрации остаточного хлора в очищенной воде. Интенсивное предварительное хлорирование и обработка воды активным углем применяются для удаления из воды соединений, вызывающих привкусы и запахи. Специальные химические соединения, используемые при коагуляции, выбирают в зависимости от свойств воды и на основании экономических соображений. Речная вода обычно требует обширного комплекса очистных сооружений, обладающего большой эксплуатационной гибкостью из-за суточных колебаний качественных показателей воды. Подготовительная стадия обработки часто заключается в предварительном отстаивании, уменьшающем количество ила и осаждаемых органических веществ перед химической очисткой. Как показано на рис. 7.2, на многих сооружениях, обрабатывающих речную воду, в целях достижения большей степени очистки и гибкости работы сооружений химическую коагуляцию и осаждение проводят в два этапа. В зависимости от тех или иных факторов для получения удовлетворительного качества очищенной воды может использоваться до двенадцати различных химических соединений.
При санитарной оценке качества подземных вод отсутствие в составе воды колиформных бактерий обычно считалось признаком отсутствия и патогенных.
Почти во всех штатах теперь требуется проведение анализа обработанной воды на колиформные бактерии; в этом случае число требуемых анализов зависит от численности обслуживаемого населения. Подсчет фекальных колиформ, хотя он обычно необязателен с точки зрения контролирующих органов, несложен и может дать дополнительную ий-формацию относительно источников загрязнения. Иногда применительно к конкретной установке специально устанавливают предельные значения некоторых показателей, таких, как концентрация остаточного хлора, мутность, содержание растворенных твердых частиц, нитратов, а также цветность. Концентрацию остаточного хлора в распределительной системе измеряют для того, чтобы определить, является ли достаточным хлорирование. Другие лабораторные анализы связаны с контролем химической обработки, выявлением и устранением некоторых проблем, возникающих в сооружениях распределительной системы, и с жалобами потребителей на качество воды. Химические реагенты должны отвечать требованиям соответствующих технических условий, и их следует подвергать традиционным анализам, причем при отклонении от технических условий на поставщика необходимо накладывать штраф. Например, известь обычно покупают с содержанием СаО 88 - 90 %, квасцы - с 17 % - ным содержанием А12Оз, а активный уголь - по спецификациям относительно содержания фенола. Если в контракте на поставку химических веществ предусмотрено наложение штрафов на поставщика на основании результатов лабораторных анализов, то это может оградить водоочистную установку от поступления в нее недоброкачественных материалов.
До стерилизации. Воздух оценивают по содержанию золотистого стафилококка, попадающего в него из верхних дыхательных путей , ротовой полости . Его считают показателем капельного загрязнения воздуха . Другими микробами, отражающими санитарное неблагополучие того или иного объекта, являются дрожжевые и плесневые грибы , синегнойная палочка , сальмонеллы.
Общие и термотолерантные колиформные бактерии (в 3 пробах по 100 мл воды)
При определении качества воды необходимо вычислить количество присутствующих колиформных бактерий , чтобы определить, отвечает ли вода установленным стандартам. Для подсчета положительных колиформных анализов (предположительных, подтверждающих и фекальных) используется (Множество бродильных трубок. При подсчете применяют метод статистической обработки результатов анализов, проводимых с последовательным разбавлением пробы. Результаты исследований представляют в виде наиболее вероятного числа колиформных бактерий (НВЧ). Например, НВЧ 10 означает, что на 100 мл воды приходится 10 колиформных бактерий.
В большинстве случаев изучение восстановления количества бактерий проводили на общей и фекальной колиформных группах бактерий. При этом вопрос о том, насколько восстановление количества колиформных бактерий опасно для здоровья, остается открытым, так как различные виды бактерий имеют разные патогенные свойства , кроме того, ни общая, ни фекальная колиформные группы бактерий не являются единственными действующими в водяной среде болезнетворными микробиологическими факторами .
Целью этой работы было исследовать явление очевидного восстановления этих трех основных подгрупп колиформных бактерий в хлорированных сточных водах. Было проведено восстановления бактерий в хлорированных водах и их выживания в нехлорированных водах. В тех случаях, когда через большие промежутки времени после хлорирования уничтожение бактерий не отличается существенно от естественного, целесообразность хлорирования сомнительна, особенно если сточные воды не сразу используются человеком после их сбрасывания.
Приведенные данные показывают насколько статистически значителен рост содержания колиформных бактерий . Было обнаружено, что увеличивается содержание всех подгрупп бактерий максимальное содержание наблюдается на четвертый или пятый день (табл. 13.5).
| Рис. 12.3. Схема типовой установки для биологической очистки сточных вод и испытания, которые необходимо проводить для определения степени эффективности ее работы / - определение параметров расхода г - грубодисперсные примеси 3 - песколовка 4-первичный отстойник 5 - осадок из первичных отстойников 5 - уплотнитель 7 - иловая вода 8 уплотненный осадок 9 - вакуум-фильтр /О -фильтрат -кондиционирующие химические вещества т - кек 13 - биологическая очистка и отстаивание 14 - избыточный активный ил 5- хлорирование С - расход 55 - содержание взвешенных веществ У55 - потери при прокаливании взвешенных веществ - сухой остаток соИ1огтз - содержание фекальных колиформных бактерий |
Эффективность процесса дезинфекции определяется анализом на группу колиформных бактерий, являющихся индикаторами качества воды. Чувствительность бактерий к хлорированию хорошо известна, в то время как влияние хлорирования на простейшие и вирусы прослеживается не совсем четко. Личинки простейших и кишечные вирусы более устойчивы к действию хлора , чем колиформы и другие кишечные бактерии. Однако имеется очень мало данных, свидетельствующих о том, что существующая практика обработки воды несовершенна. Документально не были зафиксированы вспышки болезней, связанных с употреблением воды, содержащей вирусные или протозойные инфекции.
Почти во всех штатах теперь требуется проведение анализа обработанной воды на колиформные бактерии в этом случае число требуемых анализов зависит от численности обслуживаемого населения. Подсчет фекальных колиформ, хотя он обычно необязателен с точки зрения контролирующих органов, несложен и может дать дополнительную инь формацию относительно . Иногда применительно к конкретной установке специально устанавливают предельные значения некоторых показателей , таких, как концентрация остаточного хлора, мутность, содержание растворенных твердых частиц , нитратов, а также цветность. Концентрацию остаточного хлора в распределительной системе измеряют для того, чтобы определить, является ли достаточным хлорирование. Другие лабораторные анализы связаны с контролем химической обработки, выявлением и устранением некоторых проблем, возникающих в сооружениях распределительной системы, и с жалобами потребителей на качество воды . Химические реагенты должны отвечать требованиям соответствующих технических условий , и их следует подвергать традиционным анализам, причем при отклонении от технических условий на поставщика необходимо накладывать штраф. Например, известь обычно покупают с содержанием СаО 88-90%, квасцы-с 17%-ным содержанием AI2O3, а активный уголь - по спецификациям относительно содержания фенола. Если в контракте на поставку химических веществ предусмотрено наложение штрафов на поставщика на основании результатов лабораторных анализов, то это может оградить водоочистную установку от поступления в нее недоброкачественных материалов.
Восстановлевие содержания колиформных бактерий в хлорированных водах
Начальное
Организмы – индикаторы фекального загрязнения
Использование типичных кишечных организмов в качестве индикаторов фекального загрязнения (а не самих патогенных агентов) является общепризнанным принципом мониторинга и оценки микробиологической безопасности водоснабжения. В идеале обнаружение таких индикаторных бактерий должно означать возможное присутствие всех сопутствующих такому загрязнению патогенных агентов. Индикаторные микроорганизмы должны легко выделяться из воды, идентифицироваться и количественно определяться. При этом они должны дольше выживать и в водной среде, чем патогенные агенты, и должны быть более устойчивы к обеззараживающему действию хлора, чем патогенные. Практически какой-либо один организм не может отвечать всем этим критериям, хотя многие из них имеют место в случае колиформных организмов, особенно Е. соli – важного индикатора загрязнения воды фекалиями человека и животных. Другие организмы, удовлетворяющие некоторым из этих требований, хотя и не в такой степени, как колиформные организмы, также могут в некоторых случаях использоваться в качестве дополнительных показателей фекального загрязнения.
К колифрмным организмам, используемым в качестве индикаторов фекального загрязнения, относят общие колиформы, в т.ч. и Е. соli, фекальные стрептококки, сульфитредуцирующие спороносные клостридии, особенно, клостридия перфрингенс. Есть и другие анаэробные бактерии (к примеру, бифидобактерии), в больших количествах встречающиеся в фекалиях. При этом рутинные методы их обнаружения чересчур сложны и длительны. По этой причине специалисты в области водной бактериологии остановились на простых, доступных и достоверных методах количественного обнаружения индикаторных колиформных микроорганизмов, используя в работе титрационный метод (серийных разведений) или метод мембранных фильтров.
Колиформные организмы уже давно считаются удобными микробными индикаторами качества питьевой воды, главным образом потому, что легко поддаются обнаружению и количественному определению. Это грамотрицательные палочки, они обладают способностью ферментировать лактозу при 35-37 °С (общие колиформы) и при 44-44,5 °С (термотолерантные колиформы) до кислоты и газа, оксидазоотрицательные, не образуют спор и включают виды Е. соli, цитробактер, энтеробактер, клебсиеллу.
Общие колиформные бактерии согласно СанПиНу должны отсутствовать в 100 мл питьевой воды.
Основными санитарно-показательными микроорганизмами являются бактерии группы кишечных палочек (БГКП), объединяющие 3 рода микроорганизмов - Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, входящих в семейство Enterobacteriaceae. Они обладают многими общими морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами.
В соответствии с ГОСТ 2874-82 и ГОСТ 18963-73 к БГКП относят мелкие подвижные грамотрицательные, не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу и глюкозу с образованием кислоты и газа при температуре 37 °С (в течение 5-24 ч) (рисунок 45).
Кишечные палочки (бактерии группы кишечных палочек) - это факультативные анаэробы, хорошо растущие в универсальных питательных средах, устойчивые к действию многих анилиновых красителей. Им свойственна широкая приспособительная изменчивость, в результате которой возникают разнообразные варианты, что усложняет их классификацию.
Из всех бактерий группы кишечных палочек наибольшее санитарно-показательное значение имеют микроорганизмы рода Escherichia.
По способности расщеплять лактозу при температуре 37°С БГКП делят на лактозоотрицательные и лактозоположительные кишечные палочки (ЛКП), или колиформные, которые нормируются по международным стандартам. Из групп ЛКП выделяют фекальные кишечные палочки (ФКП), которые способны ферментировать лактозу при температуре 44,5 °С. К ним относится Е. coli, не растущая на цитратной среде.
Для дифференциации бактерий группы кишечных палочек используют среду Эндо, на которой Е. coli дает характерный рост в виде колоний красного цвета с металлическим блеском.
Среда Эндо является селективной средой для энтеробактерий, выпускается в сухом виде. В ее состав входят МПА, лактоза, фуксин основной, сульфат и фосфат натрия.
Приготовление среды: в 100 см 3 дистиллированной воды растворяют 5 г. сухой среды, кипятят при постоянном помешивании
Рис. 45. Escherichia coli: a - колонии; б – клетки
2-3 мин и разливают по чашкам Петри. Для предотвращения образования большого количества конденсата среду после кипячения охлаждают до 50 °С. Готовая среда имеет розовый цвет. Колонии лактозоположительных штаммов красные (образовавшаяся молочная кислота реагирует с сульфатом натрия, в результате чего фуксин восстанавливает свой цвет), лактозоотрицательные - бесцветные или слегка розовые.
При росте БГКП на жидких питательных средах (МПБ) наблюдаются значительные помутнение среды и образование сероватого, легко разбивающегося осадка. Пленка на поверхности бульона обычно не образуется.
На МПА БГКП образуют средних размеров округлые гладкие блестящие полупрозрачные колонии.
Кишечные палочки не разжижают желатин, способны ферментировать целый ряд углеводов - лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу с образованием кислоты и газа. Ферментативные свойства (сбраживание углеводов) непостоянны, поэтому при дифференциации БГКП их учитывают не самостоятельно, а в комплексе с другими тестами.
В молоке бактерии группы кишечных палочек хорошо размножаются, доводя его кислотность до 60-80 °Т и образуя в нем неровный ноздреватый сгусток. В присутствии молочнокислых бактерий под влиянием выделяемых ими антибиотических веществ и кислоты рост кишечных палочек тормозится. При режимах пастеризации, принятых в молочной промышленности, кишечные палочки погибают. Обычные дезинфицирующие средства в общепринятых разведениях обеззараживают оборудование от этих бактерий.
Санитарно-показательное значение отдельных родов бактерий группы кишечных палочек неодинаково. Обнаружение бактерий рода Escherichia в пищевых продуктах, в воде, почве, на оборудовании свидетельствует о свежем фекальном загрязнении этих объектов, что имеет большое санитарное и эпидемиологическое значение.
Иногда считают, что бактерии родов Citrobacter и Enterobacter представляют собой измененные эшерихий после пребывания их во внешней среде. Следовательно, Citrobacter и Enterobacter являются показателями более давнего (несколько недель) фекального загрязнения и поэтому они имеют меньшее санитарно-показательное значение по сравнению с бактериями рода Escherichia.
Дифференциацию бактерий группы кишечных палочек проводят с учетом различий физиологических свойств микроорганизмов. На этой основе разработаны специальные тесты, используемые для распознавания фекальных и нефекальных кишечных палочек, основным из которых является комплекс признаков ТИМАЦ (ТЛИМАЦ):
Т -температурный тест;
И - тест индолообразования;
М - реакция с метиленовым красным;
А - реакция на ацетилметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра);
Ц - цитратный тест;
Л - ферментация лактозы.
Температурный тест (тест Эйкмана) - способность ферментировать глюкозу и другие углеводы (лактозу, маннит) с образованием газа при температуре 44-46 °С (чаще 44,5 °С). Для эшерихий температурный тест положительный, представители родов Citrobacter и Enterobacter такой способностью не обладают. Этот тест определяют на специальных средах Эйкмана, Кесслер, Булижа.
Среда Эйкмана (глюкозопептонная среда): пептон - 10 г; хлористый натрий - 5 г, глюкоза - 5 г; вода водопроводная 1 000 см 3 . В концентрированной среде состав всех ингредиентов, кроме воды, увеличен в 10 раз. Среду разливают в пробирки или колбы с бродильными трубочками (газовками), стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение 3 дней (допускается стерилизация в автоклаве при 112°С-15мин).
Тест индолообразования - способность расщеплять аминокислоту триптофан, входящую в состав многих белков, с выделением ряда продуктов, в том числе индола, окрашивающего среду при взаимодействии с реактивами, содержащими парадиметиламидобензальдегид в красный цвет. Индол продуцируют эшерихии, бактерии из родов Citrobacter и Enterobacter индола не образуют. Наличие индола определяют в старых бульонных культурах (лучше в бульоне Хоттингера с содержанием 200-300 мг % триптофана) при помощи реактива Эрлиха.
Реактив Эрлиха: парадиметиламидобензальдегида - 4 г; 96° этилового спирта - 380 см 3 ; концентрированной хлористо-водородной (соляной) кислоты - 80 см 3 . Перед добавлением (0,5-1 см 3) реактива Эрлиха к культуре в нее вносят 0,5-1 см 3 солянокислого эфира (для экстрагирования индола).
Исследования биохимических свойств Е. coli после развития в молоке с заквасками показали непостоянство индольного признака, 36 % штаммов Е. coli могут терять способность продуцировать индол. Поэтому применение этого признака при контроле кисломолочных продуктов может привести к неверным результатам.
Реакция с метиловым красным (реакция Кларка) заключается в определении интенсивности кислотообразования при ферментации глюкозы в питательной среде. В качестве индикатора используют метиловый красный, несколько капель которого добавляют к 3-5-суточной культуре, выращенной на среде Кларка. При рН 5 и ниже индикатор изменяет светло-желтый цвет на красный, что свидетельствует об интенсивном кислотообразовании. Представители родов Escherichia и Citrobacter дают красное окрашивание среды, a Enterobacter - желтое.
При рН выше 5 среда остается светло-желтой.
Среда Кларка: протеоза (или другой пептон) - 5 г; декстроза - 5 г; К 2 НРО4 - 5 г; дистиллированная вода до 800 см 3 . Смесь нагревают 20 мин, периодически помешивая, фильтруют, охлаждают, доводят объем до 1 000 см 3 дистиллированной водой. Разливают в пробирки по 10 см 3 , стерилизуют при 121 °С 15 мин.
Индикатор: метилового красного - 0,1 г; этилового спирта 300 см 3 . После растворения индикатора прибавляют 200 см 3 дистиллированной воды.
Реакция на ацетилметилкарбинол (Фогес-Проскауэра, 1898 г.) выявляет способность микроорганизмов образовывать в среде с глюкозой ароматическое вещество ацетилметилкарбинол (ацетоин).
Для постановки реакции к 5 см 3 4-5-суточной культуры, выращенной на пептонной среде с глюкозой или среде Кларка, добавляют такой же объем 40%-ного раствора КОН. Для ускорения реакции к 100 см 3 щелочи добавляют 0,3 г креатина [реактив СМеага (Мира)]. При наличии ацетилмети л карбинола среда окрашивается в розовый цвет.
Ацетилметилкарбинол (ацетоин) образуют бактерии рода Enterobacter. Эшерихии и представители рода Citrobacter такой способностью не обладают.
Цитратный тест - способность микроорганизмов усваивать. в качестве единственного источника углерода лимонную кислоту или ее соли. Изучаемую культуру высевают на цитратную синтетическую среду Козера или плотную среду Симмонса.
Бактерии родов Citrobacter и Enterobacter растут на цитратных средах (вызывают помутнение и изменение цвета в жидких и образование специфических колоний на плотных средах) и получили название цитратположительные или цитратассимилирующие бактерии , тогда как эшерихии не дают роста на указанных средах и называются цитратотрицательными .
Цитратная синтетическая среда Козера: MgSO 4 х 7Н 2 О - 0,2 г; NH 4 H 2 PO4 - 1,5 г; К 2 НРО 4 - 1 г; цитрата натрия х 5 Н 2 О - 2,53 г; дистиллированная вода - 1 000 см 3 Для определения изменения реакции среды прибавляют 10 см 3 0,5%-ного спиртового раствора бромтимолового синего.
Среда Симмонса: к среда Козера добавляют 2% агара, доводят рН до 7,2-7,4,стерилизуют в автоклаве при 112 °С в течение 15 мин. Индикатор добавляют после стерилизации, перед разливкой в стерильные пробирки. Среда имеет оливково-зеленый цвет.
При определении содержания цитратотрицательных эшерихии в кисломолочных продуктах можно получить завышенные результаты вследствие дополнительного учета представителей рода Enterobacter, потерявших способность утилизировать цитраты.
Цитратный тест должен сопровождаться микроскопией препаратов так как Enterococcus faecalis усваивает цитраты и может приниматься за цитратположительные кишечные палочки.
Ферментация лактозы присуща большинству видов семейства Enterobacteriaceae. Представители рода Escherichia (за исключением лактозоотрицательных вариантов) сбраживают лактозу, Citrobacter и Enterobacter ферментируют лактозу непостоянно. Способность микроорганизмов ферментировать лактозу изучают на специальных лактозосодержащих средах с различными индикаторами (среда Эндо, среды Гисса и др..
Довольно часто кишечные палочки могут иметь нетипичные признаки комплекса ТИМАЦ (ТЛИМАЦ), что затрудняет их дифференциацию. Это объясняется тем, что во внешней среде кишечные палочки подвергаются воздействию различных факторов, в результате чего происходит изменение ряда их биологических свойств. Например, после пребывания во внешней среде Е. coli утрачивает способность сбраживать лактозу, ферментировать углеводы при 43 °С и даже при 37 °С, но приобретает свойство ассимилировать (усваивать) цитраты.
При длительном применении антибиотиков, других лечебных препаратов в кишечнике человека также обнаруживают лактозоотрицательные варианты эшерихий.
В комплексе признаков ТИМАЦ основными являются температурный и цитратный тесты. Они наиболее стабильные, что позволяет дифференцировать бактерии группы кишечных палочек фекального происхождения от кишечных палочек, обитающих во внешней среде.
Наибольшее санитарно-показательное значение имеют кишечные палочки, не растущие в среде Козера с цитратами (как единственным источником углеродного питания) и ферментирующие углеводы при 43-45 °С (Е. coli). Они являются показателями свежего фекального загрязнения.
В молочной промышленности в качестве санитарно-показательных микроорганизмов выявляют бактерии группы кишечных палочек, посевы производят на среду Кесслер, культивируют при 37 °С 24 ч.
Приготовление модифицированной среды Кесслер: 16 г сухой среды Кесслер помещают в колбу и доливают питьевой водой до 1 000 см 3 . Смесь кипятят при помешивании 25 мин. Объем доводят питьевой водой до 1 000 см 3 и фильтруют через вату. Разливают в пробирки с поплавками по 5 см 3 или колбочки с поплавками по 40-50 см 3 и стерилизуют при 12 ГС в течение 10 мин. Среда имеет темно-фиолетовый цвет.
Допускается приготовление среды Кесслер из отдельных ингредиентов.
Для этого к 1 000 см 3 питьевой воды прибавляют 10 г пептона и 50 см 3 стерильной желчи (желчь бычья или других сельскохозяйственных животных), кипятят смесь при помешивании 25 мин и фильтруют ее через вату. В полученном фильтрате растворяют 2,5 г лактозы и доводят объем питьевой водой до 1 000 см 3 , устанавливают рН 7,4-7,6, после чего добавляют 2 см 3 раствора кристаллического фиолетового с массовой концентрацией 10 г/дм 3 , разливают в пробирки с поплавками или колбочки с поплавками по 40-50 см 3 и стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет.
Критерии санитарной оценки пищевых продуктов и других объектов внешней среды по присутствию санитарно-показательных микроорганизмов предусмотрены ГОСТами и Санитарными правилами и нормами, где указывается, что бактерии группы кишечных палочек не должны обнаруживаться в определенных количествах продукта, т.е. нормируется количество санитарно-показательных микроорганизмов в единице продукта. Так, например, в пастеризованном молоке кишечные палочки не должны выявляться в 1 см 3 , в жидкой закваске для кефира бактерии группы кишечных палочек не допускаются в 3 см 3 , в сметане и твороге - в 0,001 см 3 (г) и т.д.
ЭНТЕРОКОККИ
Систематика и биологические свойства энтерококков представлены в главе 10.
Энтерококки наряду с бактериями группы кишечных палочек являются постоянными обитателями кишечника человека и теплокровных животных, в большом количестве выделяются во внешнюю среду, и обнаружение их в пищевых продуктах, воде, почве свидетельствует о фекальном загрязнении этих объектов.
Преимущества энтерококков как санитарно-показательных микробов заключается в их большей устойчивости к физическим и химическим воздействиям, в наличии избирательных сред, позволяющих обнаружить энтерококков в сильно загрязненных объектах, в несложности дифференцировки их от сходных видов и некотором отличии энтерококков человеческого и животного происхождения, что имеет существенное значение с эпидемиологической точки зрения.
Установлено, что в кишечнике человека преобладают Ent. faecalis и его варианты, в меньшем количестве обнаруживают Ent. faecium. В содержимом кишечника крупного рогатого скота, свиней, овец, лошадей преобладает Ent. faecium. Обнаружение во внешней среде Ent. faecalis и его вариантов имеет определенное санитарное и эпидемиологическое значение как показатель загрязнения объекта фекалиями человека; обнаружение Ent. faecium является показателем загрязнения фекалиями животных.
Другими преимуществами энтерококков как санитарно-показательных микроорганизмов является то, что они не размножаются вне кишечника человека и животных (за исключением пищевых продуктов); во внешней среде не подвергаются столь глубоким изменениям, как кишечные палочки, и дольше по сравнению с ними сохраняются во внешней среде.
Имеются селективные питательные среды, позволяющие выделить энтерококки в чистой культуре из объектов, сильно обсемененных посторонней микрофлорой. Для определения энтерококков чаще используют молочную среду с полимиксином по Калине (см. главу 10).
Энтерококки чрезвычайно устойчивы к низким температурам, нагреванию, хлорированию, к повышенным концентрациям сахара и соли, к высокой кислотности. Они выдерживают температуру нагревания 60-56 °С в течение 30 мин (режимы пастеризации должны обезвреживать энтерококков), способны расти в присутствии 6,5 % NaCl, 40 % желчи, в средах с рН 9,6-10.- В связи с этим для продуктов, не подвергающихся хранению, показателем санитарного состояния являются бактерии группы кишечных палочек, а для продуктов, которые длительно хранятся при низкой температуре, лучше в качестве санитарно-показательных микроорганизмов определять энтерококки. Это объясняется тем, что кишечные палочки погибают быстрее энтерококков и присутствие или отсутствие их не отражает санитарного состояния таких продуктов.
Количество энтерококков в пищевых продуктах колеблется в довольно значительных пределах - от 10 3 до 10 6 в 1 г или 1 см 3 .
Наличие большого количества энтерококков в продуктах, подвергшихся тепловой обработке, свидетельствует о слабой эффективности пастеризации (нарушение режимов), о послепастеризационном загрязнении или о хранении их в условиях, благоприятных для развития энтерококков.
В официальных документах - Международном стандарте по исследованию питьевой воды, в Стандарте по исследованию питьевой воды и сточных вод, принятом в США, в Европейском стандарте - энтерококки приняты как дополнительный показатель санитарно-гигиенического качества воды, причем в Международном стандарте подчеркивается, что при обнаружении в исследуемой воде атипичных кишечных палочек наличие или отсутствие энтерококков являются решающим для суждения о фекальном загрязнении.
В нашей стране энтерококки наряду с бактериями группы кишечных палочек используют в качестве санитарно-показательных микроорганизмов при санитарной оценке воды открытых водоемов, особенно колодцев, вода которых используется в технологическом процессе.
Энтерококки также рекомендуют использовать в качестве санитарно-показательных микроорганизмов при оценке качества хлорирования питьевой воды, при исследовании воды минеральных источников, а также пищевых продуктов с повышенной концентрацией соли (мясных продуктов).
